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季维智院士团队与同济大学孙毅教授合作的研究

  云南网讯(记者 高艺萌)8月4日,2017年度中国生命科学十大进展交流会暨青少年科普报告会举行。中国科学院院士饶子和、程和平、邵峰、季维智及科研院所学术带头人、生命科学顶尖专家齐聚南京,向青少年传播普及生命科学知识。

  会上,饶子和院士介绍了2017年度“中国生命科学十大进展”评选的基本情况。现场还对2017年度十大生命科学领域获奖团队进行了颁奖。值得一提的是,由昆明理工大学季维智院士团队与同济大学孙毅教授合作的“中国学者首次建立基因编辑瑞特综合征猴模型”研究成果入选“十大进展”。

  颁奖仪式后,昆工季维智院士团队的陈永昌教授与其他9位获奖代表分别为来自南京中华中学、外国语学校、南师附中、金陵中学河西分校、南京九中的500多位初、高中生做了精彩的科普报告,向学生们提出了一系列充满趣味、“博士级别”的尖锐科学问题。

  自闭症(autism)是一个医学名词,最早由美国医生Kanner命名[1],又称孤独症,是一种由于神经系统发育失调导致的精神疾病,临床症状主要表现为不正常的社交及沟通能力、语言表达障碍、异常的兴趣和行为模式。由于病症非常复杂,学术上一般更多地使用自闭症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD),是一类广泛性的神经系统发育性疾病[2],包括瑞特综合征(Rett syndrome,RTT),阿斯伯格综合症(Asperger syndrome),童年瓦解性障碍(Childhood disintegrative disorder,CDD)等(图1)。

  电影《雨人》的上映使得媒体及公众对自闭症及其他罕见病的关注度进一步提升。2007年12月联合国大会通过决议,从2008年起,将每年的4月2日定为“世界自闭症关注日”,以提高人们对自闭症和相关研究与诊断以及自闭症患者的关注;2008年2月29日,欧洲罕见病组织(EURORDIS)发起了第一届国际罕见病日,随后国际上将每年2月份的最后一天定为“国际罕见病日”。全球发病率调查显示,ASD的发病率呈现不断升高的趋势,在一些地区已高达1/68[3,4],发达国家ASD的发病率显著高于发展中国家,如美国、日本和欧洲的发病率要显著高于其他地区[4,5],这可能与社会对ASD的关注度有关。调查还显示发病率还与父母的生育年龄、教育程度等成正比,一般受教育程度越高,母亲的年龄越大,可能大龄母亲的卵质量、身体素质等有所下降,导致的早产、胎儿发育不良等情况较多[6,7]。

  大部分ASD患者的病因还不明确,一般认为与环境及遗传因素都有关系。已发现同卵双胞胎中的一个患病,另一个患病的概率为60-70%;异卵双生的概率可达30%,非双生同胞患病的相关性为18%[8,9]。这说明遗传因素是导致ASD的重要因素。目前已发现多个与自闭症发病相关的基因,如与神经元突触连接及细胞黏附相关的FMR1,NLGN3/4,NRXN1,SHANK3,CNTNAP2等,与神经元活性相关的MECP2,UBE3A等[10]。由于临床诊断上首先会根据患者的病症来判断,而许多神经系统疾病会有一些共同的表现,因此在确诊某一种疾病时,通常会制定一系列的诊断标准,如必须标准、支持标注、排除标准等[11]。即便如此,仅凭临床症状还是很难确诊某一种疾病。近年来发展起来的基因测序技术为筛选致病基因做出了重大贡献,也使得疾病的诊断更为准确,这将有助于筛查ASD的致病基因。

  临床上ASD患者以男孩较为常见,而瑞特综合征(Rett Syndrome, RTT)则以女孩患者为主。现已知道,RTT是属于ASD的一种神经发育性疾病,通常导致男性胎儿在胚胎期流产,而患病的女孩在出生后6-18个月开始表现语言能力丧失、睡眠质量差、社交和认知障碍、大脑发育变缓、心电图异常、运动能力异常等综合症状。该病最早是1966年由奥地利医生Andreas Rett首先报道的[12],当时只报道了1例女性患者。1983年,Bengt Hagberg等报道了35例类似患者,较为系统地对发病过程及临床症状进行了描述,并以发现者的名字命名为Rett Syndrome[13]。随后的研究者对该疾病进行了较为全面的研究和跟踪,根据疾病的发病进程及严重程度进行了分级,包括早期停滞期、快速倒退期、假性稳定期、运动恶化晚期等[14]。1999年确定RTT是由遗传因素引起的神经发育性疾病。Huda Zoghbi等利用系统的基因筛查方法,发现MECP2基因突变缺失是导致RTT的直接原因[15]。其实早在1992年Adrian Bird团队就发现了MECP2基因,初步发现其主要参与甲基化调控过程[16]。致病基因的发现促进了实验动物模型的建立,2001年Huda Zoghbi和Adrian Bird实验室同时报道了Mecp2基因敲除的小鼠模型[17-18]。但是即便是Mecp2基因全敲的雄性小鼠也并不致死,直至6-9个月才出现后肢痉挛等轻微的神经症状,而雌性小鼠模型基本无症状。显然,小鼠模型与RTT患者男性胚胎期流产现象相悖,也不能开展高级认知功能及社交行为等测试,难以利用小鼠模型开展RTT疾病机理及治疗的研究。这也许是由于小鼠和人类的进化差异导致的。人类的大脑高度发达,不仅具有复杂的沟回以及大脑分区,体积也比小鼠大脑大得多。而非人灵长类,如猕猴及食蟹猴与人类有非常相似的遗传背景及生理特点,而且神经系统也最为接近,都具有发达的前额叶,控制着情绪、高级认知等复杂社会行为,是公认的研究人类发育及疾病、尤其是神经系统疾病最理想的动物模型。

  基因编辑技术(TALENs,CRISPR/Cas9等)为建立灵长类RTT模型开启了新的大门。我们利用CRISPR/Cas9技术首次实现了对灵长类基因组的改造[19],同时也利用TALENs系统实现了猕猴及食蟹猴的基因编辑[20]。我们选择MECP2作为靶基因,当时发现所有怀孕的雄性胎猴均在胚胎期流产,仅有1只雌性猴出生[20]。这一现象也提示可能猴模型能模拟人类患者男性致死的情况,因此我们接着做了更多的猴模型。设计的基因编辑策略是用3对TALENs质粒对MECP2基因的3号外显子进行多点切割,并将TALENs与促进DNA修复的RAD51一起注射到1细胞期胚胎, 结果发现在细胞及早期胚胎中的编辑效率比较好,因此继续做了胚胎移植,最终获得5只存活雌性食蟹猴和2只雄性食蟹猴,其余胎儿在胚胎期流产。基因测序分析发现所有存活的雌性猴均实现了基因打靶,而存活的2只雄性猴并没有实现基因编辑,对胎儿组织的分析发现,所有被打靶的雄性胎儿均在胚胎期流产(图2,A-B)。这些结果首先证明我们已经获得一批经TALENs介导的MECP2基因敲除食蟹猴,雄性致死的情况也与人类患者相符合[20,21]。对流产猴脑组织的蛋白表达分析也发现基因敲除导致MeCP2蛋白表达量显著降低[21](图2,C)。

  图2. TALENs介导的基因修饰猴模型。(A,B)基因编辑胚胎移植后的胎儿发育、出生及性别分布情况;(C,D)突变型(Mut)和野生型(WT)流产胎猴大脑皮层MeCP2蛋白的表达情况。

  上述遗传学分析已证明我们获得了MECP2基因敲除的食蟹猴。为了证明这些动物是否为可以模拟临床患者的RTT猴模型,我们开展了一系列的行为表型分析,包括睡眠节律、社交行为、对外界刺激反应的敏感程度等,发现MECP2敲除食蟹猴与正常猴相比存在显著的差异,并和临床患者的症状类似。与小鼠模型相比较,RTT猴在更多的方面与临床患者更为接近,说明这些MECP2基因敲除的食蟹猴是线. RTT猴模型与小鼠模型行为学表型及与临床患者的比较

  猴模型的优势还在于可以对其进行一些在小鼠上无法开展的测试,比如高级认知功能、情绪及社交行为、脑发育的动态监测等。通过MRI扫描对RTT猴脑结构动态变化情况的分析发现:许多脑区均发生了表面积、厚度及体积的变化(图3),并与已报道的临床病人的一些变化类似。而临床患者的检测是散点状态的,尚没有系统性、定期监测的动态变化数据。而小鼠因脑结构简单且发育速度较快,难以模拟患者情况。因此基于RTT猴模型的这些数据对于深入理解MECP2基因在灵长类大脑中的功能具有重要的参考价值。

  图3 MRI监测RTT猴模型脑结构动态变化情况(8月龄,15月龄及20月龄)。

  眼动行为是灵长类动物区别于其他哺乳动物所特有的一种行为,RTT患者与狭义的自闭症患者不同,在发病的后期会出现主动的眼神交流,这也是自闭症与RTT的区别之一。对RTT猴模型的眼动数据采集发现,RTT猴模型更倾向于关注不带情绪的面孔,而当其眼前出现猴面孔及其他物体时,对面孔的关注要更多一些(图4)。这与临床患者的情况非常类似。

  上述是我们自2012年底开始启动的通过敲除MECP2基因构建瑞特综合征猴模型的工作,相关结果于2017年5月18日发表在国际顶级生物学期刊Cell[21]上。获得的RTT猴模型很好地模拟人类患者,具有领先于其他动物同类模型的巨大优势,对RTT发病机制和治疗方法将发挥重要作用。

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